成果介绍：
本成果以严重危害安庆市番茄、黄瓜、小西葫芦、瓜蒌等重要经济作物的主要病毒为研究对象，调查主要危害这些重要经济作物的病毒类型；
以植物体内分离纯化的病毒粒子或者原核表达的病毒外壳蛋白为抗原，制备高质量的病毒单克隆抗体，研发基于病毒单克隆抗体的血清学检测技术；
创制灵敏、特异、便捷、快速的重要经济作物病毒快速检测产品，并在安庆市进行技术推广应用，为安庆市无病毒种子种苗的培育及作物病毒病的全程监测和防控提供技术及产品支撑。
成果团队：浙江大学团队
成果应用领域：农业种植类生产企业、种植大户、村集体合作社
成果转化方式：技术转让/许可、联合开发等均可
成果核心优势：
（1）对安庆市番茄、黄瓜、小西葫芦、瓜蒌进行调查采样，经鉴定，危害较重的为番茄黄化曲叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、瓜蒌斑驳花叶病毒，其中瓜蒌斑驳花叶病毒是烟草花叶病毒属新种，也是在世界范围内首次发现的新病毒。
图 :瓜蒌斑驳花叶病毒的特征。（A）疑似受病毒侵染的瓜蒌表现花叶和斑驳症状；（B）采用TrMMV特异性引物对样品进行RT-PCR检测。Lane M, GeneRuler 1 kb DNA ladder （Thermo），下同；Lane 1-14，以14份瓜蒌样本的cDNA为模板进行RT-PCR，15-16：分别以瓜蒌脱毒苗RNA反转录cDNA和ddH2O为模板进行PCR的阴性对照。（C）TrMMV的基因组结构。数字表示核苷酸的位置，列出了每个ORF编码的蛋白质。189-kDa复制酶由ORF2通过读通机制编码。MP：运动蛋白；CP：外壳蛋白。
图 基于43种烟草花叶病毒属病毒的全基因组核苷酸序列的贝叶斯系统进化分析。以烟草脆裂病毒（TRV）和印第安花生丛簇病毒（IPTV）为外群。支持值是贝叶斯后验概率
（2）分离提纯植物体内的病毒粒子，以植物体内分离纯化的病毒粒子或者原核表达的病毒外壳蛋白为抗原，免疫小鼠，将脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，生成杂交瘤细胞，筛选合适的杂交瘤细胞，进行相应的克隆和扩增，制备单克隆抗体，对抗体进行纯化，类型、亚类鉴定及效价测定并进行Western-blot分析，筛选特异性强的抗体，基于所获得的单克隆抗体，进行配对和评估。
图 TrMMV对本氏烟的侵染性。（A）TrMMV侵染性克隆构建策略示意图。通过聚合酶链式反应扩增TrMMV I和II两个重叠片段，并连接到线性化的pCB301载体。35S：花椰菜花叶病毒启动子；HDRz，丁型肝炎病毒核酶；tNos, Nos终止子。（B）TrMMV侵染性克隆接种本氏烟10 dpi和14 dpi出现的叶片卷曲和褪绿症状。（C）采用TrMMV特异性引物通过RT-PCR分析接种本氏烟系统叶TrMMV的积累。泳道1：pCB301-TrMMV接种14 d的本氏烟；泳道2:用空pCB301载体接种的对照植株；（D）pCB301-TrMMV接种本氏烟系统叶中病毒颗粒的透射电镜图。Bar = 500 nm
图 TrMMV对瓜蒌的致病性。（A）TrMMV侵染瓜蒌17 dpi时的叶花叶和斑驳症状。（B）利用TrMMV特异性引物RT-PCR分析瓜蒌接种后系统叶TrMMV RNA的积累情况。泳道1: pCB301-TrMMV接种17 dpi的瓜蒌；2: pCB301空载体接种的对照植株；（C）pCB301-TrMMV接种瓜蒌系统叶片中的典型烟草花叶病毒属病毒粒子。Bar = 200 nm
图 TrMMV在摩擦接种对本氏烟、瓜蒌及5种葫芦科作物的致病性。（A）本氏烟摩擦接种表型。用TrMMV侵染的本氏烟（之前用TrMMV侵染性克隆浸润）作为接种物，对本氏烟进行摩擦接种。用PBS缓冲液摩擦接种对照植物。（B）摩擦接种后10 d的瓜蒌表型。（C）12 dpi摩擦接种侵染甜瓜、黄瓜、西瓜、丝瓜和西葫芦植株的表型。（D）采用TrMMV特异性引物进行RT-PCR检测摩擦接种植物系统叶片中的TrMMV。Lane 1、3、5、7、9、11、13泳道:分别从摩擦接种的本氏烟、瓜蒌、甜瓜、黄瓜、西瓜、丝瓜和西葫芦植株系统叶片中采集样品；第2、4、6、8、10、12、14泳道：用PBS缓冲液模拟接种的样品。
图 TrMMV-MCS对本氏烟的致病性。（A）TrMMV-MCS系统侵染本氏烟且致病力降低。（B）RT-PCR证实TrMMV-MCS对本氏烟的系统侵染；1: pCB301空载体接种植株；2: pCB301-TrMMV接种植株；3: pCB301-TrMMV-MCS接种植株。
图 TrMMV-NbSu对本氏烟花萼的沉默效果。（A）TrMMV-NbSu接种本氏烟花萼的沉默表型；（B）本氏烟花萼内源Su基因的qRT-PCR结果
图 TrMMV-CuPDS不同片段大小对黄瓜的沉默表型
（3）本项目接下来将针对TrMMV开发灵敏、特异、便捷、快速检测技术，寻求有兴趣的企业的合作。
